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      • 蛔蟲卵測定方法
      • 點擊次數:12004 發布時間:【2019-07-01】
      • 水質  蛔蟲卵的測定  沉淀集卵法

        蛔蟲卵測定適用范圍:

        本標準規定了測定水中蛔蟲卵的沉淀集卵法。 

        本校準適用于地表水和廢水中的蛔蟲卵測定。

        當取樣體積為10L時,本方法的檢出限為5/10L(注:不銹鋼開口直壁容器應選擇10L帶刻度)

         

        規范性引用文件

        本標準內容引用了下列文件或其中的條款。凡是不注明日期的引用文件,其有效版本適用于本標準。

        HJ/T 91地表水和污水檢測技術規范

         

        方法原理:

        沉淀集卵法主要通過樣品的濃縮、雜質分離、鏡檢計數等環節對水中的蛔蟲卵進行測定。用60目全不銹鋼篩網過濾去除樣品中交大的雜質,利用蛔蟲卵比重大于水和易于沉淀的特性過夜沉淀濃縮水樣,用虹吸的放大棄去上清液,用表面活性劑吐溫80作為殘液及沉淀轉移時的清洗劑,進一步離心濃縮轉移的剩余物,收集到的濃縮物用乙酸-乙酸鈉緩沖液混勻,控制溶液PH值,獲得親水-親脂平衡,加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪類雜質,使蛔蟲卵更容易下沉。再次離心濃縮樣品并棄去上部脂肪雜質層級緩沖液層,獲得的含卵沉淀層用飽和硝酸鈉溶液混勻,于計數框中靜置漂浮后鏡檢,即可測得水樣中蛔蟲卵的數量。

         

        配套試劑和材料:

              分析時請使用符合國家標準的分析純化學試劑,試驗用水為新制備的蒸餾水或者去離子水。

        一:乙酸乙酯(C4H8O2       

        二:乙酸-乙酸鈉緩沖液:PH=4.5

        稱取15.0g三水合乙酸鈉(CH3COONa3H2O) ,溶于約800 ml實驗用水中,加入3.6 ml乙酸(CH;COOH)調節pH值至4.5 用實驗用水定容至1000 ml。此溶液保質期為30d

        三:吐溫80溶液: q (C24H4O6) =1 %o

              移取1ml吐溫80(Tween80),用實驗用水稀釋定容至1000ml,臨用現配。

        四:飽和硝酸鈉(NaNO3) 溶液

              稱取略多于實驗環境溫度對應溶解度的硝酸鈉(NaNO3),充分溶解于100g實驗用水中,用濾紙濾去殘渣,臨用現配。硝酸鈉在不同溫度下的溶解度見附錄A

         

        配套儀器和耗材:

              分析時如有量器請使用符合國家標準的A級量器

        一:顯微鏡:物鏡4x10倍,目鏡10x

        二:冰箱:0-4

        三:水平轉子離心機:帶50ml螺口尖底離心管,離心力1000g以上

        四:漩渦混合器

        五:篩網:60 ,孔徑250um 

        六:不銹鋼開口直壁容器10L(帶刻度

        七:開口直壁量筒:1000ml   A

        八:虹吸管

        九:洗瓶

        十:螺口尖底離心管50ml

        十一:一次性巴氏滴管3ml10ml

        十二:微移液器:1000ul

        十三:定量計數框:1ml網格、5ml

         

        樣品:

        HJ/T 91中對一般污染物采樣的要求,用10 L以上容積的塑料桶采樣。采樣前需用樣品蕩洗塑料桶,采集樣品量應≥10L,常溫下運回實驗室,立即進行過濾(7.1)和沉淀(7.2)

         

        分析步驟:

        一:過濾

              充分搖勻樣品,轉入不銹鋼開口直壁容器至10L刻度。如樣品中含有草梗、紙渣等較大雜質,需將樣品用篩網過濾,并用吐溫80溶液清洗篩網及雜質,洗液并入過濾后的10L樣品中。

         

        二:沉淀

              上述樣品在15 C~25 C室溫下靜置過夜沉淀12 h~24 h,用虹吸管小心吸取并棄去上清液,避免擾動,保留1 L含沉淀物的樣品,轉入1000 ml開口直壁量筒,分別用50 ml吐溫80溶液*清洗不銹鋼開口直壁容器3次,洗液并入開口直壁量筒。在15 C~25 C室溫下再次靜置過夜沉淀12h~24h,用虹吸管吸取并棄去上清液,避免擾動,保留90 ml~ 100 ml含沉淀物的樣品。

         

              1:若樣品中蛔蟲卵濃度在10倍檢出限以上(>50/10L),采樣時,可只采總量不小于1L的樣品,取1L水樣直接進行第二步的量筒沉淀濃縮。當樣品中含有草梗、紙渣等較大雜質,同樣應先將樣品用篩網過濾,并用吐溫80溶液清洗篩網及雜質,洗液并入1 L樣品中沉淀。

         

        離心:

        沉淀濃縮后的樣品(7.2) 小心轉移至3個螺口尖底離心管,分別用15 ml 吐溫80溶液*清洗開口直壁量筒3次,洗液均勻并入3個螺口尖底離心管。以1000g 的離心力(離心機轉速計算見附錄A)離心15 min,用巴氏滴管小心吸取并棄去,上清液,少量留之,避免帶出沉淀。

              用少量吐溫80溶液將3個離心管中的沉淀進行懸浮,將沉淀量少的2個離心管中的懸浮液并入沉淀量多的一個離心管中:分別用3 ml~ 5 ml吐溫80溶液*清洗被轉移懸浮液的2個離心管,每支清洗3次,確保沒有沉淀被丟棄,洗液并入沉淀量多的離心管。以1000g的離心力離心15min, 用巴氏滴管小心吸取并棄去上清液,少量留之,避免帶出沉淀。

         

        脂類雜質分離去除:

        用與離心后沉淀等體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液對沉淀進行懸浮(:離心后沉淀體積為2 ml,加入2ml緩沖液。如果離心后沉淀體積不足2ml,加入緩沖液至4 ml。以確保用乙酸乙酯浸提后,沉淀上方有足夠體積的緩沖液,便于脂類雜質層*傾出,且避免蛔蟲卵沉淀層的丟失。

              加入2倍離心后沉淀體積的乙酸乙酯,用渦旋混勻器*混合。以.1000g的離心力離心15 min 樣品被分為清晰的三層。所有的非脂肪物質、重碎片,包括蛔蟲卵、幼蟲和原生動物在底層;中間層是緩沖液層;脂肪和其他脂溶性物質在上方形成黑而厚的一層。

              將上層和中間層液體平穩傾出棄去,記錄底層沉淀體積。如有必要,可用細針在離心管壁四周對上層的脂肪層進行松動。

         

        鏡檢:

        加入5倍底層沉淀(7.4)體積的飽和硝酸鈉溶液,對分離去除脂類雜質后的含卵底層沉淀進行懸浮。該懸浮液可置于0 C~4 C冰箱冷藏保存,備檢,于1周內檢測完畢,檢測時需將其靜置至室溫。充分搖勻懸浮液,將其轉入定量計數框靜置5 min,在顯微鏡下計數,直至全部懸浮液鏡檢完成。分別用1 ml飽和硝酸鈉溶液充分洗滌鏡檢完的離心管3次,將洗液轉入定量計數框,按以上步驟鏡檢。所有檢測到的蛔蟲卵全部計數。

              鏡檢時,需保持環境條件的穩定,無震動和風擾,緩移計數框,自上而下“U”型逐列計數。蛔蟲卵鑒定方法見附錄B

         

        空白對照試驗:

        10L同批次試驗用水,按以上采樣及分析步驟進行全程序樣品的測定。

         

        結果計算于表示:

        計算結果:

        C------水樣中蛔蟲卵濃度(個/10L

        N-----檢測到的所有蛔蟲卵數(個)

        Q-----實際水樣體積(10L

         

        結果表示:

              水質中蛔蟲卵的測定,實驗終結果取整數,以“個/10L”為單位

         

        精密度:

        6家實驗室分別對實際樣品和低濃度(20 /10L)、中濃度(40 /10L)、高濃度(80/10L)自配樣品的蛔蟲卵進行測定,實驗室內相對標準偏差范圍分別為:6.5%~18.9%10.1%~22.0%12.8%~23.8% 8.9%~ 17.4%;實驗室間相對標準偏差分別為5.8%5. 5%4.9%4.8%; 重復性限(/10L)2443711;再現性限(/10L)2603711

         

        質量保證和質量控制:

              每批次樣品至少做1個全程序空白實驗,并取10%的樣品進行平行樣測定,全程序空白實驗不得檢出蛔蟲卵,平行樣間的相對偏差不得超過30%

         

        廢物處理:

              實驗中虹吸液煮沸10min后可按普通廢棄物處理,含乙酸乙酯的廢棄液應集中保管,委托有資質的單位進行處理。

         

        注意事項:

        實驗用過的器具均需進行高溫滅活,置于水中煮沸10min后方可再次使用。

              實驗操作人員要注意自身防護,試驗時要穿戴工作服、乳膠手套、及口罩等,同時還要避免蛔蟲卵的樣品污染實驗室環境。

         

         

         

         

         

        附錄A

        硝酸鈉水中溶解度、離心機離心力及轉速計算公式

        A.1  硝酸鈉在水中的溶解度

        A.1   硝酸鈉水中溶解度

        溫度(℃)

        溶解度(g

        0

        73

        10

        80

        20

        87

        30

        95

        40

        103

        A.2離心力計算公式:

         

        附錄B

        蛔蟲卵的檢定

        B.1蛔蟲卵的形態特征

        B.1.1受精蛔蟲卵

              蟲卵呈短橢圓形,大小為45 μm~75 μmx35 μm~ 50 μm。卵殼很厚,自外向內分為三層:受精膜、殼質層和蛔甙層,殼質層較厚,另兩層極薄,在普通顯微鏡下難以分清。卵殼內有一個大而圓未分裂的受精卵細胞,與卵殼間常見有新月形空隙。卵殼外有一層由蟲體子宮分泌形成的蛋白質膜,其表面凹凸不平呈波浪狀。隨糞便排出的蟲卵常被膽汁染成黃色或棕褐色。

         

        B.1.2未受精蛔蟲卵

              蟲卵呈長橢圓形或不規則形,大小為88 μm~94 μmx39 μm ~44 μm,卵殼與蛋自質膜均較受精蛔蟲卵薄,淡黃色,無蛔甙層,卵殼內含有許多大小不一的屈光顆粒。

         

        B.1.3感染期蛔蟲卵

              卵內含有一.條卷曲的幼蟲。

         

        B.1.4蛋白質膜脫落的蛔蟲卵

              若蛔蟲卵的蛋白質膜脫落,卵殼則呈無色透明,應注意與其他線蟲卵的鑒別。

         

        B.2蛔蟲卵參考圖片

        B.2.1蛔蟲卵模式圖

         

        B.2.2發育各階段的蛔蟲卵

         

        附錄C

        蛔蟲卵配置樣品的制備

        豬蛔蟲(Ascaris suum)活成蟲采集自屠宰場,用蒸餾水洗滌干凈后,放置于含4 %甲醛溶液內,0 C~4 C保存備用,可長期保存。

         

              制備蛔蟲卵備用液時,選取2~3條雌性蛔蟲,用75 %乙醇消毒過的解剖刀,劃開蟲體,每條蛔蟲一- 對子宮選取靠近陰門的一段(2 mm~3 mm),解剖后,將含蛔蟲卵的內容物及組織碎片放入50ml離心管中,加入數顆直徑1mm玻璃珠及10ml生理鹽水,混勻后于渦旋混勻器振蕩3min~5min,260目網過篩,取40ml生理鹽水分數次沖洗離心管和篩網,此時獲得的濾液中蛔蟲卵呈單個狀態存在。濾液加入甲醛至終濃度為4%0 C~4 C保存備用,可保存1個月。即制即用時可不添加甲醛。

         

              制備配制樣品時,搖勻蛔蟲卵備用液,用1000 μ1微量移液器,立即吸取適量的蛔蟲卵備用液于1ml定量計數框(網格)中,計數后用250μl微量移液器向計數框中添加或移出蛔蟲卵至所需數量。將計數框中所有的液體用吐溫80溶液沖洗入配制樣品中。再在顯微鏡下檢測計數框,確保無蛔蟲卵殘留。


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